CAPITULO III

"Filete de culebra palustre,
Hervido en la paila y cocido al horno;
Ojo de lagartija y dedo de rana,
Pelos de murciélago y lengua de perro,
Lengüeta de víbora y aguijón de salamandra,
Pata de lagarto y ala de lechuza,
Para un encantamiento de efecto poderoso,
Como un caldo infernal hirviente y burbujeante."

William Shakespeare, Macbeth.

LA FORMACION DE COMPLEJOS IONICOS DE POLIETERES CARBOXILICOS Y SU SELECTIVIDAD IONICA. Un resumen de Resultados.

Los resultados que a continuación se presentan constituyen una aportación original a la literatura del campo del transporte iónico mediado por acarreadores modelo, sobre las propiedades fisicoquímicas de la formación de complejos individuales que, por sí solos, atestiguan la capacidad de los antibióticos poliéteres carboxílicos para interactuar de manera íntima y diferencial con una gran diversidad de cationes metálicos, independientemente de su capacidad para translocarlos.

Los objetivos.

En el presente trabajo se ha buscado identificar los factores termodinámicos y estructurales que, para los poliéteres carboxílicos de la familia de la nigericina, permiten reconocer su capacidad para formar ligandos iónicos móviles o fijos en membranas lipídicas. Al respecto, se estudiaron los patrones de selectividad y las propiedades de interacción iónica de los poliéteres nigericina, monensina y lasalócido A (Figura 3.1). Estas moléculas fueron proporcionadas por los Laboratorios Hoffman-La Roche, de Nutley, New Jersey, los Laboratorios Ely-Lilly, de Indianapolis, Indiana y los Laboratorios Sigma, de Saint Louis, Missouri.

El objetivo general del presente proyecto ha sido determinar los factores fisicoquímicos ambientales y de estructura molecular que regulan la interacción poliéter carboxílico-catión para correlacionarlos con su capacidad para catalizar el transporte iónico a través de membranas lipídicas y con sus efectos en la transferencia y conservación de energía en el metabolismo de los seres vivos. Se ha intentado alcanzar este objetivo general mediante los siguientes objetivos particulares:

A. Discernir las bases de organización molecular de los poliéteres mencionados en la formación de complejos con los cationes de metales alcalinos, alcalinotérreos (Ca2+) y lantánidos (Pr3+) para determinar sus perfiles de interacción iónica.

B. Distinguir las bases de organización molecular en la agregación para relacionarla con la capacidad de transporte de los ionóforos.

C. Identificar los perfiles de interacción de los poliéteres en medios de hidrofobicidad y polaridad variable para correlacionarla con su capacidad de transporte a través de membranas lipídicas.

D. Determinar las características del transporte o quelación de los poliéteres para presentar un modelo predictivo de la regulación de la translocación iónica.

a) b)
c) d)
Figura 3.1.
Estructura química de los poliéteres carboxílicos a) calcimicina, b) lasalócido A, c) monensina y d) nigericina.

Los antibióticos poliéteres como acarreadores modelo.

Los antibióticos poliéteres son una familia de productos naturales que se aislaron, inicialmente, de varias cepas de bacterias filamentosas o actinomicetos (Prosser y Palleroni, 1982; Liu, 1982) y poseen una potente actividad como agentes antimicrobianos, anticoccidiales (Ruff, 1982) y cardioactivos (Sutko y cols., 1977; Gachon y Moins, 1982; Moins y cols., 1982; Osborne y cols., 1982a; Hanley y Slack, 1982; Reed y Bokoch, 1982; Osborne y cols., 1982b) (Tabla 3.1). El mecanismo de la acción antimicrobiana de estos antibióticos fue descrito por primera ocasión hace ya más de un cuarto de siglo. En 1967, Estrada O. y cols. descubrieron que el modo de acción de uno de estos antibióticos, la nigericina, está asociado a su capacidad para catalizar el intercambio de K+ por H+ a través de membranas lipídicas.

Tabla 3.1. Características generales de algunos poliéteres carboxílicos.a

Por esta capacidad para transportar iones a través de membranas lipídicas, tanto biológicas como artificiales, estos antibióticos fueron bautizados, por Pressman y cols. (1967), como "ionóforos carboxílicos".

En la actualidad se cuenta con alrededor de un centenar de antibióticos poliéteres carboxílicos, muchos de los cuales han sido aislados de diferentes cepas de actinomicetos, mientras que algunos han sido el producto de síntesis química (Westley, 1982). Todos ellos tienen un peso molecular que se encuentra entre 500 y 1,000 daltones (Tabla 3.2).

Tabla 3.2. Poliéteres carboxílicos más estudiados desde 1951.a

La propiedad que caracteriza a cada uno de los antibióticos poliéteres es su diferente selectividad para complejar iones de metales alcalinos o alcalinotérreos y transportarlos a través de membranas lipídicas (Pressman y cols., 1967; Reed, 1979; Szabo, 1981; Taylor y cols., 1982; Gad y cols., 1985). Estas selectividades han sido determinadas en diferentes sistemas, tanto de membranas biológicas como artificiales (Tabla 3.3).

Tabla 3.3. Perfiles de selectividad iónica de algunos poliéteres carboxílicos, obtenidos en diferentes sistemas experimentales.

Por lo anterior, estos ionóforos han servido como valiosos modelos para ilustrar las características dinámicas de acarreadores en membranas (Eisenman, 1968; Pressman, 1968; Pressman, 1973), así como un enfoque para dilucidar las bases moleculares de la discriminación iónica en diversos sistemas biológicos (Reed, 1982).

También han sido ampliamente usados como herramientas para estudiar el papel que los gradientes iónicos de Na+, K+ y Ca2+ desempeñan en el metabolismo (Feinstein y cols., 1977; Shamoo y Murphy, 1979; Malaisse y cols., 1980; Breitbart, 1981; Reed, 1982; Lombardini, 1985; Nuñez y Glass, 1985; Soltoff y Mandel, 1986), así como en sistemas naturales que transforman energía, como mitocondrias intactas (Graven y cols., 1966; Graven y cols., 1967; Estrada- O. y cols., 1967; Pressman, 1969; Wipf y Simon, 1970; Chapel y cols., 1979; Hatefi y cols., 1982), partículas submitocondriales (Montal y cols., 1970), bacterias (Guffanti y cols., 1979; Ahmed y Booth, 1983), bacterias fotosintéticas (Rott y Avi-Dor, 1977), partículas subbacteriales (Garty y cols., 1979), algas (Doughty y Diehn, 1982), cloroplastos (Packer, 1967; Larkum y Boardman, 1974; Walker, 1975; Telfer y cols., 1975; Ben-Hayyim y Krause, 1980), tilacoides (Bulychev y Vredenberg, 1976) y microsomas vegetales (Sze, 1980).

Las propiedades fisicoquímicas y el transporte.

Todos los ionóforos carboxílicos contienen dentro de su estructura química una variedad de átomos de oxígeno (O) en anillos tetrahidrofuranos y tetrahidropiranos que participan como donadores de e- para coordinar con cationes metálicos (Westley, 1982). Además poseen, por lo general, un grupo carboxilo (R-COOH) terminal que es el que les confiere el apellido de "carboxílicos" (Figura 3.1). Al otro extremo de la molécula se encuentran uno o más grupos hidroxilo (R-OH). Son estos grupos los que pueden establecer puentes de hidrógeno (puentes H) con el R-COOH terminal (Duesler y Paul, 1982; Anteunis, 1982), por lo que la molécula se cierra formando una estructura de poliéter macrocíclico.

En 1968, Steinrauf y cols. determinaron, por difracción de rayos-X, la estructura macrocíclica cristalina de la sal de plata del ionóforo monocarboxílico nigericina. En la Figura 3.2 se puede observar que al formarse un complejo, la esfera de hidratación del metal es sustituida por su coordinación con los oxígenos 1, 2, 5, 6 y 7 de la molécula. Posteriormente, estudios de espectroscopía de resonancia magnética nuclear de protón (1H-NMR) en solución en CDCl3, realizados por Rodios y Anteunis (1977), muestran que en el complejo con Na+ también el O8 participa en la clatración del metal. Las diferencias entre ambas condiciones experimentales sugieren que la nigericina puede sufrir variaciones en la geometría de coordinación con el metal unido y, por lo tanto, que podría atrapar cationes con diferente estructura electrónica y número de coordinación.

Figura 3.2. Estructura química del complejo nigericina-catión.

Desde que lo manifestó Pressman (1968), se ha considerado que los ionóforos tipo nigericina transportan a los cationes de metales alcalinos como dipolos eléctricamente neutros. Se ha propuesto el siguiente modelo para explicar el mecanismo de transporte tipo antiporte (K+/H+) mediado por la nigericina (Figura 3.3):

La carga negativa del anión carboxilato (R-COO-) anula la carga positiva del catión complejado, de tal manera que el complejo formado es un zwitterion eléctricamente neutro. Este se mueve o difunde a través de la matriz lipídica membranal, hasta el lado en el que la concentración del catión es menor, donde se disocia el complejo. En este caso, no es la carga de los iones (H+ y alcalinos), sino sus actividades químicas o concentraciones las que mueven al ionóforo.

Figura 3.3. Modelo del mecanismo de transporte antiporte (K+/H+) catalizado por la nigericina.

Una vez disociado el complejo, la nigericina adquiere de nuevo la carga negativa del R-COO-; la presencia de cationes hidrógeno o protones provoca que el R-COO- se protone a R-COOH y que el ionóforo regrese al lado de donde tomó al catión K+ para sustituirlo por el H+, con lo que se completa un ciclo de transporte catiónico eléctricamente neutro.

Este modelo explica claramente los resultados obtenidos en membranas mitocondriales intactas por Estrada O. y cols. en 1967, así como los observados en membranas mitocondriales, de eritrocitos y artificiales de fosfolípidos (Henderson y cols., 1969), que muestran un intercambio equitativo de K+/H+ mediado por nigericina.

La flexibilidad molecular de la nigericina.

Sin embargo, ya en 1967, Estrada O. y cols. encontraron que, si bien a concentraciones bajas -menores de 0.1 µM- se promueve un intercambio antiporte 1:1, a concentraciones mayores del poliéter, la nigericina estimula la hidrólisis de ATP en mitocondrias intactas en presencia de K+, lo que -de acuerdo con la hipótesis quimiosmótica de Mitchell (1961)- sugiere que, además de actuar como intercambiador electroneutro, este ionóforo podría transportar carga neta a través de la membrana, a favor del gradiente de potencial eléctrico.

Por otra parte, Taylor y cols. (1982) mencionan que existe evidencia de que otros poliéteres carboxílicos, como la grisorixina, la alborixina y el lasalócido A, comparten este mecanismo de transporte de carga eléctrica, aunque consideran que "este modo de acción parece ser de menor importancia comparado con la actividad electroneutra".

Posteriormente, con estos antecedentes, Markin y cols. (1975) y Toro y cols. (1976) demostraron por separado -en experimentos de conductimetría en membranas de bicapas lipídicas (BLM)- que, efectivamente, la nigericina transporta carga neta y que, además, forma aglomerados moleculares de proporción o estequiometría (poliéter:catión) de 2:1.

Más recientemente, en colaboración con Toro (1987) encontramos que la nigericina también cataliza la transferencia de carga neta a través de BLM, a pH 4, en presencia de K+ con una estequiometría poliéter:metal de 3:1.

Todos estos resultados demuestran de manera definitiva la gran plasticidad de la nigericina para formar oligómeros móviles, en función del pH del medio y la concentración del poliéter, a partir de la agregación de monómeros en presencia de K+. Por otro lado, estos cambios en la molecularidad afectan, si bien levemente, el orden de selectividad iónica para el transporte mediado por la nigericina.

Los resultados.

A la luz de la flexibilidad mostrada por la nigericina, durante el desarrollo del presente trabajo se encontró que este poliéter sí puede formar complejos de requerimientos energéticos equivalentes con los cationes Li+, Na+, K+, Rb+ y Cs+, aunque a la fecha no existe evidencia -en los sistemas experimentales tradicionales- de que todos estos cationes sean translocados. Los estudios espectroscópicos en 1H-NMR de la nigericina muestran modificaciones notables en presencia de Li+ y Cs+. Los ensanchamientos de algunas señales escogidas de acuerdo con los datos publicados por Rodios y Anteunis (1977) y Toro y cols. (1987), sugieren un cambio importante en la movilidad de estas regiones dentro de la estructura de la molécula. Estos efectos deben adjudicarse a la influencia de cada catión dentro de la corona de coordinación del poliéter.

Son estos hallazgos -la flexibilidad molecular mostrada por la nigericina y su aparente capacidad para interactuar con Li+ y Cs+, que son cationes monovalentes a los que no transporta- los que conducen a considerar que los ionóforos monocarboxílicos puedan tener un perfil de interacción iónica mucho más amplio que el supuesto hasta ahora.

Con el fin de comprender la relación entre estructura y actividad ionoforética, se buscaron datos que hicieran evidentes los cambios conformacionales que debieran ocurrir en otros poliéteres -monensina y lasalócido A- cuando interactúan con cationes metálicos alcalinos y de transición.

Así, se buscó establecer la forma en que se asocian dichos poliéteres con los cationes alcalinos, con Ca2+ y con Pr3+.

Para determinar la influencia del solvente en la conformación de los poliéteres estudiados, se utilizaron dos solventes: uno polar, etanol absoluto, y otro no polar, n-hexano. Los resultados permiten establecer la flexibilidad molecular de ambos poliéteres.

Con estas evidencias se busca contribuir a determinar las bases fisicoquímicas de la formación de complejos iónicos de los poliéteres carboxílicos nigericina, monensina y lasalócido A, para correlacionarlas con su actividad ionoforética. Esto se logró mediante la siguiente estrategia experimental:

La formación de los ácidos libres

Los poliéteres, monensina y lasalócido A, se obtuvieron de los laboratorios Sigma, en forma de la sal de sodio. Se formaron los ácidos libres para eliminar posibles influencias del ion Na+ en la formación de los complejos (Gertenbach y Popov, 1975; Cox y cols., 1984). Se disolvió la sal de sodio del poliéter en CHCl3. Se agregó HCl 0.1 N; se agitó durante 15 minuntos. Se dejó reposar de 90 a 120 minutos; se extrajo la fase acuosa, quedando sólo la fase orgánica. Esto se repitió tres veces a partir del punto donde se agrega el ácido 0.1 N.

Posteriormente, se evaporó la fase orgánica a sequedad a baño María bajo corriente de N2(g) y se liofilizó durante 3 horas. Finalmente, se cuantificó el contenido de Na(I) de las fases acuosas por espectrofotometría de absorción atómica o por fotometría de emisión de flama. El contenido de Na+ en 10 mg de la sal comercial de monensina es, por ejemplo, de 33.2 ppm. La extracción en este sistema desplaza 99.09% del Na+.

Las sales de sodio de los poliéteres son insolubles en CCl4, mientras que son solubles en etanol absoluto y en CHCl3. En cambio, las formas protonadas de los poliéteres son solubles en los tres solventes mencionados.

Estabilidad en la formación de los complejos poliéter-catión.

Los valores de pKa de los poliéteres nigericina, monensina y lasalócido A se determinaron en un medio homogéneo de permitividad relativa (er) de 38.48, para conocer la facilidad de disociación ácida de estas moléculas, así como para observar el efecto que la capacidad dieléctrica del medio produce en ella. El pKa es un parámetro que indica la capacidad de una molécula para disociarse de sus protones. Este parámetro se relaciona con el tamaño de la molécula y los grupos substituyentes que ésta posea. El pKa de los ácidos libres de la nigericina, de la monensina y del lasalócido A, se obtuvo por titulación potenciométrica con hidróxido de tetrametil amonio (TMAOH) 1.0 M, estandarizado, en una solución de 1,4-dioxano/H2O 45 % (v/v) (Tabla 3.4). La titulación se realizó con agitación continua y a temperatura constante de 25 °C.

La factibilidad termodinámica de la interacción poliéter-catión se verificó mediante de la determinación de las constantes de estabilidad (Ks) de la reacción de formación de los complejos en solución, en una sola fase homogénea a temperatura constante (25 °C), por técnicas potenciométricas con electrodos ionselectivos para los cationes monovalentes, y colorimétricas con indicadores metalocrómicos para los polivalentes -antipirilazo III (APIII) 50 µM para el ion Ca2+ (Scarpa y cols., 1978a) y muréxido 40 µM para el Pr3+ (Scarpa y cols., 1978b). Las determinaciones se hicieron al equilibrio, teniendo 100 µM del poliéter y concentraciones equimolares de cloruro del catión en cuestión. Los experimentos se hicieron en la solución homogénea de er 38.48 a pH = pKa, como se publicó previamente para el complejo de nigericina-K+ (Toro y cols., 1987).

Tabla 3.4. Valores de pKa para los poliéteres nigericina, monensina y lasalócido en un medio de er 38.48a.

Por las propiedades electrolíticas de los metales alcalinos en solución, la determinación potenciométrica en una sola fase homogénea es una técnica apropiada para confirmar la interacción de los poliéteres con los cationes Li+, Na+, K+, Rb+ y Cs+. Los valores de RT/ZF de las curvas de calibración con los cationes metálicos sugieren que la baja er del medio (38.48) -comparada con la del agua pura (er = 78.54)- afecta la respuesta de los electrodos. Sin embargo, las lecturas de DE°, en función de -log [M+], son estadísticamente significativas, por lo que los valores obtenidos son confiables. La diferencia más importante en el poder de resolución de la técnica potenciométrica la representa la selectividad intrínseca de los electrodos usados; en particular la del Beckman 39047, que puede verse influida por la movilidad de los cationes hidratados en la solución empleada.

La Tabla 3.5 muestra los valores de log Ks obtenidos para los complejos de los poliéteres nigericina, monensina y lasalócido A con los cationes Li+, Na+, Cs+, Ca2+ y Pr3+ en solución homogénea.

Tabla 3.5. Valores de log Ks para los complejos poliéter-catióna.

Los valores de log Ks sugieren que la nigericina forma complejos tres órdenes de magnitud más estables con los cationes Li+ y Na+ que la monensina; mientras que su estabilidad con Cs+ es cuatro órdenes de magnitud más alta. Por otro lado, si bien la secuencia de estabilidad del lasalócido A con los cationes alcalinos, similar a la de la nigericina, los valores de log Ks son de cuatro a cinco órdenes más pequeños que para la nigericina. Por su parte, la monensina muestra un comportamiento diferente a los otros dos poliéteres; los valores de log Ks con los tres cationes alcalinos muestran que este poliéter forma los complejos más estables con Na+ que con Li+ y mucho más que con Cs+.

Tocante a la interacción de los ionóforos estudiados con los cationes polivalentes, es notable que los valores de log Ks sean muy pequeños -más de cuatro órdenes menores que con los cationes alcalinos- y, segundo, similares entre los tres antibióticos. Los resultados sugieren que en solución, los complejos poliéter-catión son tres órdenes menos estables con Pr3+ que con Ca2+.

La estimación de los valores de DG° (Tabla 3.6), a partir de los datos de log Ks, muestran que la nigericina y el lasalócido A pueden interactuar, cada uno por su lado, de manera equivalente con los tres cationes alcalinos probados en solución, aunque el lasalócido se muestra más inestable con tales iones metálicos. El caso de la monensina es diferente, ya que su interacción es termodinámicamente más factible con Na+ y Li+ que con Cs+.

Tabla 3.6. Valores de DG° para los complejos poliéter-catióna.

Por su parte, las estimaciones de DG° sugieren que la formación de los complejos poliéter-catión polivalente, Ca2+ o Pr3+, no está termodinámicamente favorecida en solución.

Tasas de unión.

Las tasas de unión nigericina-catión se obtuvieron por titulación potenciométrica en el mismo medio utilizado para la determinación de las Ks. Los experimentos se hicieron a concentración constante de los ácidos libres de los poliéteres, añadiendo el catión metálico y graficando su tasa de unión como una función de [METAL UNIDO]/[METAL TOTAL], según describe Smith (1981). Durante la titulación se midió el desplazamiento de ion H+ como cambio en el pH del medio experimental.

El comportamiento de la unión del poliéter con los cationes alcalinos se siguió con electrodos ionselectivos en solución homogénea. La Figura 3.4 muestra las isotermas de unión nigericina-metal en función de la concentración de metal total a concentración constante de poliéter. Con cada catión alcalino ensayado se observa una aparente reacción de primer orden. Sin embargo, existen diferencias en la tasa de unión del poliéter con los distintos metales. Los cationes Li+ y Cs+ muestran tasas de unión más rápidas que los iones Na+, K+ y Rb+; no obstante, los pequeños iones Li+ y Na+ presentan valores de saturación más altos que los cationes alcalinos más grandes.

Figura 3.4. Isotermas de unión nigericina-catión en solución homogénea en una sola fase a pH 7.76 y er 38.48, como en la Tabla 3.5. La concentración inicial de poliéter fue de 112 ± 6 µM.

Formación de complejos por saturación.

Los complejos de los poliéteres monensina y lasalócido A se formaron por saturación del ácido libre del poliéter con sales inorgánicas de los cationes Na+, Li+, Ca2+ y Pr3+; se utilizaron sales no solubles en CHCl3, siguiendo la técnica propuesta por Toro y cols., (1987).

Para cada complejo se tomaron 10 mg de ácido libre de poliéter y se disolvieron en CHCl3. Se agregaron 100 equivalentes de sal inorgánica del catión en turno, divididos en tres partes. En cada agregado se agitó vigorosamente durante 3 minutos. La sal inorgánica se sedimentó por centrifugación a 3000 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante se pasó a otro tubo y el precipitado del primero se lavó con 2 ml de CHCl3, agitando manualmente y se dejó sedimentar por gravedad; el sobrenadante se pasó al segundo tubo y el contenido (complejo poliéter-catión) se concentró a baño María bajo corriente de N2(g) hasta un volumen de 2 ml. Esto se repitió cinco veces, hasta completar 500 equivalentes de catión por poliéter. Se pasó el sobrenadante por un filtro resistente a solventes orgánicos con diámetro de poro de 0.45 µm; se evaporó a sequedad a baño María bajo corriente de N2(g).

Para incrementar el rendimiento, los precipitados formados en los cinco tubos cónicos se lavaron cada uno con 2 ml de CHCl3; se agitaron y se centrifugaron. Los sobrenadantes se filtraron y liofilizaron.

Las sales inorgánicas empleadas fueron Na2CO3 (Merck) grado analítico; Li2CO3 (Merck) grado analítico; CaCO3 (J.T. Baker) grado reactivo y PrCl3 (ICN) grado reactivo.

La interacción del ácido libre de monensina con la sal inorgánica de Na+, dio como resultado la formación de un sólido cristalino opaco soluble en etanol absoluto y en CHCl3. La saturación del mismo ácido libre con Li2CO3 formó un sólido cristalino transparente, soluble en CHCl3 y en etanol.

La interacción de la monensina con CaCO3 produjo un sólido en forma de polvo blanco muy fino que también fue soluble en CHCl3 y en etanol absoluto. Finalmente, la interacción del ácido libre de monensina con PrCl3 dio un sólido transparente soluble en CHCl3 y en etanol absoluto.

La interacción del ácido libre del poliéter lasalócido A con la sal Na2CO3 formó un sólido cristalino soluble en CHCl3, en etanol absoluto y en n-hexano; en este último solvente, se tuvo que dar una ligera agitación en mezcladora a temperatura ambiente. La interacción con Li2CO3 proporcionó un sólido cristalino muy soluble en CHCl3, soluble en etanol absoluto y en n-hexano. La saturación con CaCO3 dio un sólido blanco, soluble en CHCl3, en etanol y en n-hexano. Finalmente, la interacción con PrCl3 formó un sólido cristalino con una ligera tonalidad verde que pone de manifiesto la interacción del lasalócido A con el catión Pr3+. Este complejo es soluble en CHCl3, en etanol absoluto y es ligeramente soluble en n-hexano.

Estequiometría poliéter-catión.

La proporción de los cationes Na+ y Li+ en los complejos formados con cada uno de los poliéteres se cuantificó por flamofotometría. Para el poliéter monensina, se cuantificaron su sal de sodio (5.0 mg en 10 ml de etanol/agua al 90%); el complejo con Na+ (3.4 mg en 5 ml de etanol/agua al 90%) y el complejo con Li+ (2.8 mg en 5 ml de etanol/agua al 90%). Para el lasalócido A, se cuantificó el catión Na+ del anterior complejo formado (4.7 mg en 10 ml de etanol/agua al 90%) y el complejo formado con Li+ (3.0 mg en 5 ml de etanol/agua al 90%).

Para calcular las estequiometrías poliéter:catión se empleó la relación [I]/[C], donde [I] es la concentración molar del poliéter y [C] es la concentración molar del catión.

La formación de complejos de los poliéteres con Ca2+, se detectó por espectrofotometría en presencia de 0.05 mM de la sal de sodio del indicador metalocrómico AP-III (ICN) (Scarpa y cols., 1978a). Las muestras de cada complejo de poliéter-Ca2+ (1.5 mg) y los controles (ácidos libres), se digirieron con HNO3 concentrado; se evaporó a sequedad en baño de aceite mineral; se diluyeron con agua desionizada y se agitaron. Cada solución se pasó a una cámara de vidrio con refrigeración empleando agitación continua y se midió el pH. El pH se ajustó a 4.0 empleando TMAOH. Finalmente, se agregó un volumen igual de solución de AP III 0.1 mM.

Para cuantificar el catión Pr3+ se utilizó el indicador metalocrómico muréxido (Merck) 0.035 mM para valoración (Scarpa y cols., 1978b) a pH 5.0. Las muestras de cada complejo se procesaron como se hizo con las de los complejos poliéter-Ca2+. Las curvas y las muestras se leyeron a 471 nm.

Las relaciones estequiométricas resultantes de los complejos de monensina y lasalócido A con los cationes metálicos ensayados se muestran en la Tabla 3.7.

Tabla 3.7. Proporciones estequiométricas de los complejos de monensina y lasalócido A con Li+, Na+, Ca2+ y Pr3+.a

Los valores muestran que la estequiometría de la monensina con ambos cationes alcalinos, Li+ y Na+, es 1:1 y con el alcalinotérreo Ca2+, divalente, es de 2:1, mientras que tiene una unión muy inespecífica con el lantánido Pr3+, trivalente, siendo su estequiometría de 17:1. Mientras se desarrollaba el presente trabajo experimental, apareció un reporte independiente sobre la formación de dímeros de monensina con cationes divalentes (Hebrant y cols., 1992).

Por su parte, en los datos para el poliéter lasalócido A los valores muestran que la estequiometría con Na+ es 1:1, con Ca2+ es 2:1 y se aprecia que tanto para el Pr3+ como para el Li+, la proporción resulta ser 3:1, mientras que las pruebas con K+ y Rb+ sugieren relaciones con valores de 3:2 en ambos casos.

Identificación de los complejos poliéter-catión.

La interacción de los poliéteres monensina y lasalócido A en su forma de ácido libre o protonado, con cationes alcalinos, con Ca2+ y con Pr3+, se hizo evidente por las diferencias en el espectro de absorción ultravioleta-visible (UV/VIS) del ácido libre y las sales correspondientes de ambos poliéteres. Los espectros en UV se leyeron en el intervalo de 200-300 nm de longitud de onda (l) para la monensina y de 200-350 nm para el lasalócido A; se emplearon celdas cuadradas de cuarzo de 3 ml y de 1 cm de paso de luz.

Los espectros en UV de los complejos de monensina en etanol absoluto, del ácido libre y la sal de sodio muestran marcadas diferencias entre sí que sugieren cambios conformacionales en todas las formas (Figura 3.5).

Los valores de coeficiente de extinción (e) para la sal de sodio de la monensina revelan una respuesta muy pobre comparada con las demás formas del poliéter; aunque se puede apreciar un pico de absorción máxima a 208 nm. El ácido libre muestra un pico de absorción máxima a 227 nm y un pico más pequeño a 277 nm. Los aspectos más importantes en el espectro del complejo con Na+, revelan un pico de absorción máxima a 206 nm y la extinción del pico de absorción máxima observado a 227 nm en el ácido libre, mientras que la señal a 277 nm que se observa en el ácido libre, en el complejo con Na+ disminuye en intensidad. Se debe hacer notar que las absorbencias máximas en ambos espectros son similares, con e mayores de 2500 M-1cm-1.

Figura 3.5. Espectros de absorción UV de diversas formas del poliéter monensina en etanol absoluto.

La interacción del ácido libre de monensina con los cationes polivalentes, produce un notable efecto hipercrómico, con un marcado incremento en el e de la molécula, principalmente en la región del UV lejano (200-250 nm).

En el complejo de la monensina con Ca2+ se muestra el pico de absorbencia máxima a 206 nm que se observa en el ácido libre. También, aparece un pico a 220 nm que no se encuentra en las formas anteriores. En el complejo con Pr3+ se observa un gran ensanchamiento con absorbencia máxima a 215 nm, además de mostrar el mayor efecto hipercrómico a casi todo lo largo del espectro del ácido libre.

Los corrimientos en la absorción UV del lasalócido A dependientes de catión se estudiaron en etanol. En el intervalo de l estudiado generalmente se observaron tres bandas principales de absorción: l1 cerca de 210 nm, l2 cerca de 245 nm y l3 cerca de 310 nm; en todos los casos la l1 fue la de máxima absorbencia (Figuras 3.6 y 3.7).

 

Figura 3.6. Espectros de absorción UV de diversas formas del poliéter lasalócido A en etanol absoluto.

Respecto al ácido libre del lasalócido A se pueden notar tres tipos de características: primero, los valores de e sufren un abatimiento cuando el ácido libre se une a los cationes alcalinos Li+ y Cs+, mientras que aumentan con K+ y Rb+. Por otro lado, en las bandas l2 y l3 aparecen corrimientos al azul cuando hay cationes alcalinos presentes; los hombros en l2 se producen por el corrimiento de esta banda de contribución aromática p ® p* y contribuyen al incremento de la extinción de l1. Finalmente, aparecen efectos hipercrómicos y corrimientos al rojo de la banda de absorción l1 con los cationes Ca2+ y Pr3+ (Figura 3.7). Es notable que l2 no se corra ni se abata cuando el ácido lasalócido A se une a Ca2+ y Pr3+ y, por lo tanto, no contribuya a la absorción de l1. Es evidente que la intensidad de la absorción en el UV depende de la conformación del complejo lasalócido-catión formado.

Figura 3.7. Espectros de absorción UV de diversas formas del poliéter lasalócido A en etanol absoluto.

Los espectros de dicroísmo circular (DC) de las diferentes formas de la nigericina, la monensina y el lasalócido A, se corrieron en etanol absoluto en un espectropolarímetro Jasco J-500A, calibrado con ácido (+)-10-canfor-sulfónico (Hennessey y Johnson, 1982), y una celda circular de 1 ml, de 1 mm de paso de luz y en n-hexano en una celda circular de 1 ml de 0.5 mm de paso de luz.

Los espectros en DC de las sales de sodio, ácidos libres y complejos de la nigericina y la monensina en etanol absoluto, no muestran bandas de absorción en el intervalo estudiado. A pesar de poseer múltiples centros quirales, ambas moléculas son ópticamente inactivas en esta región del espectro.

La actividad óptica de la molécula de lasalócido A exhibe tres bandas de dicroísmo circular que se correlacionan con las bandas de abosorción electrónica UV, l1, l2 y l3 mostrados en las Figuras 3.6 y 3.7. La solución etanólica del ácido libre del lasalócido A presenta dos bandas de elipticidad molar ([q]) negativas, l2 a 245 nm y l3 a 292 nm. También se distingue una banda de [q] positiva (l1) a 215 nm (Figura 3.8). Este dicroísmo positivo aparentemente continúa por debajo de los 200 nm tanto en solución etanólica como en n-hexano. La [q] negativa del lasalócido A en etanol se incrementa en presencia de Na+. Este aumento es mayor en la sal de sodio, donde el grupo -COOH del radical salicílico está disociado; éste se asocia con un pequeño corrimiento al rojo de la banda l3. Además, el catión Na+ induce un cambio en la banda l1, de positivo a negativo. Cuando se comparan las bandas negativas del complejo de Na+ protonado y las de la sal de sodio, la [q] de l1 es proporcionalmente mayor que la [q] de l2 y l3 en el primero que en la segunda.

Figura 3.8. Espectros DC del poliéter lasalócido A con cationes alcalinos en etanol (a) y en n-hexano (b).

La disolución del ácido libre del lasalócido A en n-hexano provoca que la banda l1 se corra al azul y se vuelva negativa, junto con un incremento significativo de la banda negativa l2, que se vuelve máxima (Figura 3.8). En las muestras con Na+, las magnitudes de los picos l2 y l3 son aproximadamente dos veces más grandes en n-hexano que en etanol, mientras que la [q] de l1 se incrementa casi diez veces en solución hidrofóbica. De nuevo, la [q] de l1 es mayor en el complejo protonado de Na+ que en la sal de sodio.

Los complejos protonados de lasalócido A-K+ y lasalócido A-Rb+ despliegan un comportamiento de las bandas de absorción en DC similar al de las muestras con Na+. La Figura 3.8 muestra que el complejo de K+ produce bandas de DC en las mismas l que el complejo con Na+. En contraste, el complejo con Rb+ manifiesta un importante corrimiento de l1 al rojo. Los valores de [q], tanto del complejo con K+ como del de Rb+, en etanol son mayores que los de las muestras de lasalócido A-Na+. Estos incrementos parecen correlacionarse con el aumento en la proporción estequiométrica de poliéter:catión. Por otro lado, el n-hexano aumenta los valores de [q] de los complejos de K+ y Rb+, pero no modifica las frecuencias de las bandas l2 y l3.

Otros casos de agregación de poliéteres despliegan características dependientes del catión y del solvente. El Li+, el Ca2+ y el Pr3+ producen corrimientos al azul de las bandas de DC l1, l2 y l3 del ácido libre del lasalócido A en etanol, con una secuencia general de Pr3+ > Ca2+ > Li+ (Figura 3.9). Los valores absolutos de [q] en l3 son mayores cuando los cationes polivalentes se unen al lasalócido A. La interacción lasalócido A-Pr3+ incrementa la [q] positiva de l1 a 208 nm, mientras que los cationes Li+ y Ca2+ vuelven negativa a l1 a 213 y 207 nm, respectivamente. Sin embargo, el complejo de lasalócido A-Li+ aún muestra [q] positiva a 200 nm.

Figura 3.9. Espectros DC de complejos oligoméricos del poliéter lasalócido A con Li+, Ca2+ y Pr3+ en etanol (a) y en n-hexano (b).

Cuando estos últimos complejos se disuelven en n-hexano, sus bandas de DC no se corren respecto a las del ácido libre del lasalócido A (Figura 3.9). Además, los valores de [q] se abaten. Con Li+ se obtienen [q] mayores en l2 y l3. Tanto el espectro del complejo con Li+ como con Ca2+ se asemejan en gran medida al del ácido libre del lasalócido A. Finalmente, ya que el complejo con Pr3+ es ligeramente soluble en n-hexano, los datos de DC obtenidos no resultan confiables.

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© Raúl Alva*, México, Agosto de 1995.
*Profesor-Investigador de la Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, México.